支原體污染一直是細胞生物學研究面臨的主要問題之一，因為它們會影響或改變細胞的生理機能。由于其寄生特性和適應宿主細胞的能力，支原體經常作為污染物出現在細胞培養物中。 [1]
支原體沒有細胞壁。出于這個原因，它們對靶向細菌細胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，這些抗生素通常用于細胞培養。細胞壁的缺乏以及它們的小尺寸（通常為 0.2 - 0.3 ?m）也使它們在傳統顯微鏡下的檢測變得復雜。它們的小尺寸和非常靈活的形式也意味著支原體不能通過無菌過濾從液體介質中去除。
由于缺乏宏觀效應，支原體可能長期未被發現。特別是在使用標準抗生素的日常工作中，實驗室工作人員的支原體污染可能會在很長一段時間內未被發現，因為其他細菌的污染通過添加抗生素而被選擇性抑制，而同時引入的支原體可以不受阻礙地繁殖。
鑒于此，許多研究表明細胞培養物的支原體污染水平高達 40% 也就不足為奇了。這些高污染水平的一個可能原因被認為是由實驗室工作人員、血清或胰蛋白酶、外來細胞培養物（交叉污染）或最終由收獲細胞培養物的動物引入的。 [3]
文獻：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯圖加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
由于污染的存在會影響從細胞培養中獲得的結果的準確性，或者在最壞的情況下，會損害細胞生長到整個培養物丟失的程度，因此必須定期檢查細胞培養物中是否存在支原體污染。特別是在細胞轉染中必須排除支原體污染，因為污染對細胞生長和代謝的負面影響會導致轉染效率急劇下降。
支原體是軟體菌類中的幾個細菌屬之一。軟體動物是人類、動物和植物的微小寄生蟲或共生體；根據定義，支原體屬的 100 多種*物種僅限于脊椎動物宿主，在那里它們被稱為許多疾病的病原體（例如由肺炎支原體引起的肺炎）。
細胞表面支原體菌落的電子顯微鏡圖像 [2]
支原體細胞非常小，沒有細胞壁。因此，它們不受靶向細胞壁合成的抗生素的影響。支原體的基因組大小范圍為 0.58 – 1.38 兆堿基對，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自動復制能力的原核生物中最小的。
作為需氧或兼性厭氧生物，支原體與其宿主理想地對齊，因此因此在細胞培養物 (37°C) 中找到最佳生長條件。
...損害細胞生長
...降低宿主細胞的代謝活性
...調節細胞的細胞因子產生
...在體外誘導染色體畸變
...通過標準無菌過濾器
...對抗生素如青霉素或鏈霉素具有抗性通常用于細胞培養
...耐高溫和脫水
...影響轉染效率
支原體可以在幾乎所有已知的細胞類型中增殖，因此無處不在。據估計，大約 80% 的日本細胞培養物、65% 的阿根廷細胞培養物和 15% 的美國細胞培養物被支原體污染。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 細胞生長的廣泛影響。
由于支原體污染具有不可見且不會導致細胞死亡的特殊特性，因此污染可能會在很長一段時間內未被發現。然而，這些細菌對轉染成功有廣泛的影響：
• 由于精氨酸需求增加，細胞生長顯著減少
• 支原體調節細胞因子的產生
• 支原體導致染色體畸變
• 支原體滯留在細胞膜中，并可能調節細胞膜過程，例如內吞作用。
所有這些操縱的生理過程也參與轉染過程。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 和 HepG2 細胞的廣泛影響：與未污染細胞相比，效率分別提高了 17% 和 5.6%。
在 48 孔板上用 pCMV?gal 轉染 HeLa 和 HepG2 細胞。通過 ONPG 和 BCA 分析評估比吸收值。左邊的條形顯示由支原體污染導致的轉染效率大大降低。
DAPI染色
在細胞培養物中檢測支原體的一個流行應用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色細胞。DAPI 強烈嵌入 DNA 的小溝中，并在紫外線激發下在最大 460 nm 處顯示出相對較寬的熒光發射。在無支原體細胞培養中，僅標記細胞核。如果存在支原體細胞，它們的 DNA 也會被標記。由于它們的體積小，單個支原體細胞無法在熒光顯微鏡下分辨：只有高度污染會導致可見的模糊面紗形成，這可能無法清楚地識別。
聚合酶鏈反應
更靈敏的支原體檢測方法是 PCR。可以在非常早期的污染和低濃度狀態下檢測細胞培養物中的支原體。這種檢測方法通常適用于細胞培養工作。
其他
雖然 ELISA 測試經常用于支原體的常規檢測，但這種方法在靈敏度和特異性方面并不優于 DAPI 測試。另一種方法是電子顯微鏡，然而，它需要先進的設備并且更耗時。
結論
為確保細胞培養物中支原體污染引起的諸多問題最終成為過去，Biontex 提供了一系列基于 PCR 的檢測支原體檢測試劑盒：
MycoSPY®（常規 PCR 檢測試劑盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 檢測試劑盒，包括 Master Mix 和用于凝膠電泳的上樣緩沖液和示蹤染料
該產品對已建立的細胞系和原代細胞均取得了優異的結果。
 | |
用 DAPI 染色的 Cos7 細胞，無 | DAPI 染色未能揭示 |
 | |
當存在* 水平的支原體污染時，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細胞僅在細胞外圍 | 所有這三種 |
| 方法 | DAPI-測試 | 酶聯免疫吸附試驗 | MycoSPY® | 電子顯微鏡 |
|---|---|---|---|---|
| 努力 | + | + | + | -- |
| 費用 | ++ | 0 | + | -- |
| 靈敏度 | -- | - | ++ | + |
| 全部的 | + | 0 | ++++ | --－ |
對于被細菌污染的細胞培養物的處理，通常使用標準抗生素。但是作用于細胞壁的抗生素（如青霉素）對支原體無效。
因此，我們提供產品MycoRAZOR®，這是一種抗生素混合物，可損害蛋白質生物合成（轉錄和翻譯）。
是的。重要的是檢查支原體是否已被MycoRAZOR®（例如，通過使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）*消除，以防止產生耐藥性。由于耐藥性的產生方式與所有抗生素的使用方式相同，因此*消除支原體至關重要。
首先檢查是否在上次使用MycoRAZOR®和當前測試之間進行了兩次未使用MycoRAZOR®的傳代。如果不是這種情況，則可能已檢測到死支原體，特別是通過高度敏感的方法，例如 PCR。如果觀察到最后一次應用和測試之間的最短時間，請在接下來的五次細胞傳代中使用MycoRAZOR®，逐漸增加MycoRAZOR®的劑量，最大稀釋度為 1/25。請注意，根據細胞類型，增加MycoRAZOR®的濃度可能會產生毒性作用. 如果您在細胞中觀察到毒性作用（增殖率降低；細胞形態變化），請在剩余周期中使用最后一次使用的劑量。必須使用支原體檢測試劑盒（例如MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）測試每種治療的結果！
細胞培養中使用的動物產品是支原體污染的主要來源。為避免這種風險，請僅使用保證不含支原體的胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶。
支原體屬于 Mollicutes 類，因此缺乏細胞壁，它們對許多攻擊細胞壁合成的抗生素具有抗性。因此，在將此類抗生素（例如青霉素/鏈霉素）用于細胞培養的常規使用中，使用者本身是重要的污染源。在這種情況下，非無菌工作條件會被忽視，因為添加抗生素會阻止大多數細菌的生長——從而阻止宏觀效應——同時允許支原體不受阻礙地繁殖。
此外，來自另一種細胞培養物的交叉污染是可能的。出于這個原因，始終測試所有培養的細胞并更換任何可能被污染的細胞培養材料（培養基、FBS、胰蛋白酶、緩沖液）。
第MycoRAZOR®不包含任何doxy-或四環素類抗生素。
大多數基于 PCR 的支原體檢測試劑盒都包含一個質粒作為陽性對照，該質粒編碼支原體的 16S rRNA。這確保了引物的功能。如果存在支原體污染，該質粒產生的 DNA 擴增子的大小與預期的相同或相似。因此，帶有陽性對照的 PCR 必須在單獨的管中進行。通常還包括內部對照，以確保 PCR 不受來自細胞培養上清液的蛋白質和細胞碎片的抑制。內部對照產生與支原體污染的細胞樣本不同長度的 DNA 擴增子。因此，內部控制可以在每種方法中進行。
MycoSPY® Master Mix試劑盒和MycoSPY®試劑盒中包含的內部對照是一種質粒，它編碼支原體 16S rRNA 的縮短形式。因此，內部對照用作陽性對照，并確保對于每種 PCR 方法，細胞培養上清液中不存在抑制劑。因此，它排除了假陰性結果。
兩者MycoSPY®主混合物的試劑盒和MycoSPY®試劑盒檢測至少80份支原體基因組的。內部控制稍微降低了靈敏度。由于支原體在細胞培養物受到污染后繁殖相對較快，因此這種敏感性就足夠了。
因此，我們建議在每次 PCR 中添加內部對照，以確保不存在來自細胞培養上清液的任何現有抑制劑（蛋白質、細胞碎片）。
沒有必要避免使用常規抗生素，例如青霉素、鏈霉素或慶大霉素，因為它們不會抑制MycoSPY® Master Mix Kit 或MycoSPY®試劑盒的檢測。
是的。我們建議在 20°C 下儲存，不含添加劑（例如 DMSO）。解凍后，應按照手冊中的說明制備細胞培養上清液。
我們建議將細胞培養至少 48-72 小時，或直到生長區域的覆蓋率至少達到 80%。對于懸浮細胞，細胞密度應大約在推薦用于傳代培養的細胞數范圍內。由于在細胞培養上清液中檢測到支原體，因此在此期間不應更換培養基。
我們建議至少每 1-2 個月進行一次支原體 PCR（例如使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix），尤其是在存在抗生素（例如 pen/strep）的情況下培養細胞時。這些抗生素可防止發現未消毒的工作技術，但會導致細胞培養物受到支原體污染。
