BioCheck，Inc。為醫療保健市場和研究市場開發，制造和分銷免疫診斷檢測試劑盒和研究試劑。

我們的新產品包括用于研究應用的兔單克隆抗體，用于小鼠和人類Id1，Id2，Id3和Id4蛋白，抗體用于HMGA2的研究應用。

BioCheck pd-1酶免疫測定試劑盒說明書

PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT

pd-1酶免疫測定試劑盒

Enzyme Immunoassay for the Quantitative Determination of PD-1 Concentration in Human Serum and Plasma

酶免疫法定量測定人血清和血漿中Pd-1濃度

目錄編號：bc-1301

只作研究用途，而非用于診斷程序。

介紹

程序性細胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一種細胞表面受體，對調節T細胞炎癥活動和維持外周免疫耐受至關重要。 系統(1)。pd-1可以與配體pd-l1和pd-l2相互作用。pd-1具有胞外IGV結構域、跨膜結構域和帶有兩個磷酸化位點(shp-1和shp-2)的胞內尾。 下調免疫系統，抑制T細胞活性(2)?？乖R別后，活化的T細胞在其表面表達pd-1，產生干擾素，誘導P的表達。 d-L1，從而促進細胞凋亡或細胞死亡。(3)當pd-1配體被腫瘤細胞劫持時，其異常表達抑制了免疫調節T細胞的活化，導致疾病進展。 <物>離子 (4).

血清和血漿中Pd-1水平升高與類風濕關節炎和皮膚硬化有關(5，6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤的T細胞(7)表達.進一步再 研究表明，使用針對pd-1免疫檢查點的單克隆抗體有助于在理解和治療黑色素瘤和其他內翻等癌癥方面取得突破性進展。 非小細胞肺癌(4)。

測定原理

pd-1酶聯免疫吸附試驗是以固相酶聯免疫吸附試驗為基礎的.該檢測系統利用一種*的單克隆抗體對，針對一種*的抗原性測定方法。 Pd-1分子上的螞蟻。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體進行固相固定(在微滴度井上).另一種與辣根結合的單克隆抗pd-1抗體 H過氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測試樣品被允許與這兩種抗體順序反應，導致pd-1分子被夾在固體p之間。 Hase和酶聯抗體。在室溫下進行兩次單獨的60分鐘孵育后，用洗滌緩沖液沖洗水井，除去未結合的標記抗體。TMB試劑添加了一個 ND在黑暗條件下孵育20分鐘，形成藍色。隨著停止解決方案的添加，顏色開發停止，將顏色更改為黃色。這，這個，那，那個 Pd-1濃度與樣品的顯色強度成正比.在450 nm處分光度法測定吸光度。

試劑準備

所有試劑在使用前應允許達到室溫(18-25°C)。

2.對于每次測試運行，準備一個新的標準集。

3.用標準/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標準/樣品稀釋劑制備10 ng/mL標準的雙倍系列稀釋劑：

a.10 ng/mL：0.12mL 50 ng/mL，0.48mL標準品/樣品稀釋劑b。5 ng/mL：0.25mL 10 ng/mL標準品/樣品稀釋劑c。2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標準品/樣品 稀釋劑d.1.25 ng/mL：0.25 mL，2.5 ng/ml，0.25 mL標準品/樣品稀釋劑e。0.625 ng/mL：1.25ng/mL標準品/樣品稀釋劑f的0.25ng/mL。0.313 ng/mL：0.25mL，0.625 ng/mL 0。 25 mL標準/樣品稀釋劑

h.0.156 ng/mL：0.25mL，0.313 ng/mL，0.25mL標準稀釋劑I。0 ng/mL：0.25 mL標準稀釋劑

病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與180 L標準/樣品稀釋劑混合。

6.工作洗滌緩沖器：從20倍庫存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩定運行30天.注：任何水晶 由于高鹽濃度而可能出現的S，必須在室溫下重新溶解，然后再進行稀釋。

檢測程序

準備標準。見試劑準備。

稀釋樣品1：4稀釋。見試劑準備。

確保所需數量的涂層井在保持架。

配發Pd-1標準的100mL，并將樣品稀釋到適當的井中.

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養皿中的內容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水性紙或吸塵器上。 用毛巾去除所有殘留的水滴。

將Pd-1工作酶結合劑的100mL配伍到每口井中.

8.室溫(18-25°C)孵育60 min.

9.將培養皿中的內容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸收紙上或 紙巾去除所有殘留水滴。

10.在每口井中分配100mL TMB溶液。

11.室溫(18-25°C)孵育20分鐘.

12.通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應。

13.輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍色*變成黃色。

14.在450 nm處讀取吸光度，15分鐘內使用微滴度良好的閱讀器。

統計

計算每組參考標準、對照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。

通過繪制每個參考標準的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上，并在垂直(Y)軸上繪制吸光度，從而構造一條標準曲線。 在水平(X)軸上的比率。

用每個樣品的平均吸光度值，從標準曲線上測定相應的Pd-1濃度(ng/mL)。取決于經驗和/或計算機的可用性 能力，可以采用其他的數據縮減方法。

4.樣品的檢出值應乘以稀釋倍數為4，得到Pd-1的結果為ng/ml。

標準曲線實例

一個典型的標準運行結果，吸光度讀數在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-1濃度顯示在X軸上。注：本標準曲線為圖示目的。 僅用于計算未知數，不應用于計算未知數。每個實驗室必須在每個實驗中生成自己的數據和標準曲線。

工作特性

從零標準的平均值用2SD法測定的Pd-1ELISA低可檢出濃度為0.15ng/ml。

精度a.在一次測定中，通過對三種不同樣品的重復測定，確定了內測精密度.批內可變性如下所示：

b. 在一系列單獨校準的測試中，通過對三個不同樣本的重復測量，確定了運行間精密度。試驗間的可變性顯示為貝爾。 表示突然疼痛所發出的聲音

3、回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-1水平，并一式兩份進行測定。平均回收率為105.3%。

b.對三個樣品進行連續稀釋，以確定線性度。平均回收率為99.6%。

REFERENCES

1. Fife, B. T., & Pauken, K. E. (2011). The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Annals of the New York Academy of Sciences, 1217(1), 45-59
2. Riella, L. V., Paterson, A. M., Sharpe, A. H., & Chandraker, A. (2012). Role of the PD-1 Pathway in the Immune Response. American Journal of Transplantation : Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons, 12(10), 2575–2587.
3. Zak, Krzysztof & Kitel, Rados?aw & Przetocka, Sara & Golik, Przemys?aw & Guzik, Katarzyna & Musielak, Bogdan & Dömling, Alexander & Dubin, Grzegorz & Holak, Tad. (2015). Structure of the Complex of Human Programmed Death 1, PD-1, and Its Ligand PD- L1. Structure. 23. . 10.1016/j.str.2015.09.010.
4. Zoran Gatalica, Carrie Snyder, Todd Maney, Anatole Ghazalpour, Daniel Holterman, Nianqing Xiao, Peggy Overberg, Inga Rose, Gargi D. Basu, Semir Vranic, Henry T. Lynch, Daniel D. Von Hoff and Omid Hamid. Programmed Cell Death 1 (PD-1) and Its Ligand (PD-L1) in Common Cancers and Their Correlation with Molecular Cancer Type. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. December 1 2014 (23) (12) 2965- 2970.
5. Greisen, S., Rasmussen, T., Stengaard-Pedersen, K., Hetland, M., Hørslev-Petersen, K., Hvid, M., & Deleuran, B. (2013). Increased soluble programmed death-1 (sPD-1) is associated with disease activity and radiographic progression in early rheumatoid arthritis. Scandinavian Journal of Rheumatology,43(2), 101-108.
6. Yanaba, K., Hayashi, M., Yoshihara, Y., & Nakagawa, H. (2016). Serum levels of soluble programmed death-1 and programmed death ligand-1 in systemic sclerosis: Association with extent of skin sclerosis. The Journal of Dermatology,43(8), 954-957.

7. Ahmadzadeh, M., Johnson, L. A., Heemskerk, B., Wunderlich, J. R., Dudley, M. E., White, D. E., & Rosenberg, S. A. (2009). Tumor antigen–specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood, 114(8), 1537–1544