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Reddot Biotech Inc.目前專注于銷售用于制藥，實驗室，醫學和科研用途的試劑和相關產品。我們致力于研究和開發，為客戶提供高質量的產品，為任何研究提供準確，可靠和快速的結果。憑借與各大洲公司和研究機構合作的豐富經驗，我們為我們提供的產品和服務提供了巨大的價值。

人血管緊張素II受體1（AGTR1）ELISA試劑盒RD-AGTR1-HuHuman Angiotensin II Receptor 1 (AGTR1) ELISA Kit

Reddotbiotech  常見問題解答

傳統的ELISA試劑盒與即用型ELISA試劑盒

我們新的“即用型”ELISA試劑盒具有以下特點：

• 縮短實驗時間
• 預稀釋檢測試劑
• 增強穩定性，允許在4 o C下儲存整個試劑盒

這些試劑盒仍然保持我們高水平的質量和靈敏度，以及我們12個月的保質期。

與傳統的ELISA試劑盒相比，我們的即用型試劑盒使用起來更容易，更快捷。

提供的試劑和材料

所需材料但未提供套件

• 微孔板讀數器，450±10nm濾光片。
• 精密單通道或多通道移液器和一次性吸頭。
• 微量離心管用于稀釋。
• 去離子水或蒸餾水。
• 用于印跡微量滴定板的吸水紙。
• 稀釋洗滌緩沖液的容器。

存放套件

對于未開封的套件

傳統的ELISA試劑盒：所有試劑應根據樣品瓶上的標簽保存。的TMB底物，洗滌緩沖液（30X濃縮物）和終止溶液應在被存儲4 ö Ç 在接收而其他人應在-20 Ô Ç 。

即用型ELISA試劑盒：所有試劑應在收到后于4 o C儲存。

打開套件

打開試劑盒后，仍需要根據上述儲存條件儲存剩余的試劑。此外，將未使用的孔返回到含有干燥劑包的鋁箔袋中，并沿著拉鏈密封的整個邊緣重新密封。

注意：

有關套件的失效日期，請參閱套件盒上的標簽。在此日期之前，所有組件都是穩定的

強烈建議在開封后1個月內使用剩余的試劑。

樣品采集和存儲

請注意您感興趣的套件推薦哪些樣品類型。

血清

使用血清分離管，讓樣品在室溫下凝固2小時或在4℃下過夜，然后以約1000×g離心20分鐘。立即測定新鮮制備的血清，或將樣品分裝在-20℃或-80℃下備用。避免反復凍/融循環。

等離子體

使用EDTA或肝素作為抗凝血劑收集血漿。在收集后30分鐘內，在2-8℃下以1000×g離心樣品15分鐘。立即去除血漿并進行檢測，或將樣品保存在-20℃或-80℃的等分試樣中以備后用。避免反復凍/融循環。

組織勻漿

組織勻漿的制備將根據組織類型而變化。通常，組織應在冰冷的PBS（0.02mol / L，pH 7.0-7.2）中*沖洗以除去過量的血液并在均質化前稱重。將組織切成小塊并在冰上用玻璃勻漿器在5-10mL PBS中均化（Micro Tissue Grinders也起作用）。應使用超聲波細胞破碎器對所得懸浮液進行超聲處理，或進行兩次凍融循環以進一步破壞細胞膜。之后，勻漿應以5000×g離心5分鐘。立即取出上清液并進行分析，或等分試樣并在≤-20℃下儲存。

細胞裂解物

根據以下說明，在測定前必須裂解細胞：

• 應用胰蛋白酶分離貼壁細胞，然后通過離心收集（懸浮細胞可通過直接離心收集）。
• 在冷PBS中洗滌細胞三次。
• 在1X PBS中重懸細胞并進行4次超聲波處理（或在≤-20℃下冷凍細胞。輕輕混合解凍細胞。重復凍融循環3次。）
• 在2 - 8℃下以1500×g離心10分鐘以除去細胞碎片。細胞培養上清液和其他生物液體 - 以1000×g離心20分鐘。立即去除顆粒物并進行分析，或將樣品分裝在-20℃或-80℃的等分試樣中。避免反復凍/融循環。

唾液

使用收集裝置或等同物收集唾液。在2-8在1000×g下離心15分鐘樣品ö C.在≤-20刪除在等分試樣的微粒，并立即檢測，或將ö C.避免反復冷凍/解凍循環。

尿

無菌收集當天的批尿液（中游），直接收集到無菌容器中。離心機以除去顆粒物質，測定立即或等分試樣并儲存在≤-20 ö C.避免反復凍融。

牛奶

用于以2 10,000×G下離心15分鐘的樣品- 8 ø C.收集總共3個周期的水性餾分和離心機兩次以上。立即測定或將樣品分裝在-20 o C或-80 o C以備后用。避免反復凍/融循環。

淚液，細胞培養上清液和其他生物液體

以1000×g離心樣品20分鐘。立即去除顆粒物并進行檢測，或將樣品保存在-20 o C或-80 o C的等分試樣中。避免反復凍/融循環。

注意：                                              

• 樣品在5天內可以被存儲在4使用Ô C，否則樣品必須儲存在-20 Ô C（≤1月）或-80 Ô C（≤2個月），以避免生物活性和/或污染的損失。
• 樣品溶血會影響結果; 不會檢測到用作樣本的溶血標本。
• 進行測定時，將樣品置于室溫下。

試劑準備

*使用前將所有試劑盒組分和樣品置于室溫（18-25 o C）。

標準 

用標準稀釋劑重新配制標準品，在室溫下保持10分鐘，輕輕搖動（不要起泡）。有關儲備溶液中標準濃度的信息，請參閱手冊。準備7管含有0.5mL標準稀釋劑的試管，并使用稀釋的標準品生產雙稀釋系列。在下次轉移之前*混合每個管。

檢測試劑A和檢測試劑B.

傳統的ELISA試劑盒：使用前短暫旋轉或離心檢測A和檢測B溶液。分別用Assay Diluent A和B稀釋至工作濃度（1：100）。

即用型ELISA試劑盒：檢測溶液A和B的濃度已經正確，無需進一步稀釋。

洗液 

用580mL去離子水或蒸餾水稀釋20mL洗滌液濃縮物（30×），制備600mL洗滌液（1×）。

TMB底物 

用滅菌的吸頭吸取所需劑量的溶液。不要將殘留的溶液倒回到小瓶中。

注意：

• 不要直接在孔中進行連續稀釋。
• 在進行測定后15分鐘內制備標準品。不要直接在37 o C 溶解試劑。
• 檢測試劑A和B是粘性溶液，因此慢慢移液它們以減少體積誤差。
• 傳統的ELISA試劑盒：根據說明小心地重新構建標準品或使用檢測試劑A和B，避免起泡并輕輕混合直至晶體*溶解。為了大限度地減少移液造成的不性，請使用小體積并確保移液器已校準。建議一次移液10μL以上以確保準確性。                 
• 即用型ELISA試劑盒：重組標準品只能使用一次。
• 重構的標準品，檢測試劑A和檢測試劑B只能使用一次。
• 如果在洗滌液濃縮物（30×）中形成晶體，則溫熱至室溫并輕輕混合直至晶體*溶解。
• 試劑制備過程中使用的任何污染水或容器都會影響檢測結果。

樣品制備

• Reddot Biotech僅對試劑盒本身負責，而不是對試驗過程中消耗的樣品負責。實驗者應該在開始實驗之前總是計算所需的樣品總量。
• 實驗者還應該在開始之前預測大致的濃度。如果預期值不在標準曲線范圍內，建議確定樣品的宜稀釋度。
• 如果您使用的樣品類型未在手冊中指出，則應在開始實際實驗之前進行初步實驗以確保試劑盒的有效性。
• 建議不要使用化學裂解緩沖液來制備組織或細胞提取樣品，因為它可能會由于裂解緩沖液的含量而導致意外的反應和結果。
• 由于其他來源的抗原與我們試劑盒中使用的抗體之間可能存在錯配，因此不建議使用其他制造商生產的天然或重組蛋白，因為我們的試劑盒可能無法識別它們。
• 我們的試劑盒可能無法檢測到細胞培養上清液中的樣品，因為它們很容易受到細胞活力，細胞數量和/或取樣時間等因素的影響。
• 建議將未經長期儲存的新鮮樣品與我們的試劑盒一起使用。如果樣品長時間未冷凍保存，可能會發生蛋白質降解和變性，導致結果相互矛盾或不正確。

分析程序

用于夾心ELISA試劑盒

• 確定稀釋標準品，空白樣品和樣品的孔。為標準準備7口井，為空白準備1口井。每種稀釋標準品（讀取試劑制備），空白和樣品加入100μL到適當的孔中。用Plate密封劑蓋住。在37 o C 孵育2小時。
• 從每個井中取出液體，不要洗。
• 向每個孔中加入100μL檢測試劑A工作溶液（即用型試劑盒中的檢測溶液A）。用Plate密封劑覆蓋后，在37 o C 孵育1小時。
• 吸出溶液，用噴槍，多通道移液器，歧管分配器或自動洗衣機在每個孔中用350μL1×洗滌液洗滌，靜置1~2分鐘。通過將板輕敲到吸水紙上，*從所有孔中除去剩余的液體。*洗凈3次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾析除去任何剩余的洗滌緩沖液。翻轉平板并將其吸附在吸水紙上。
• 向每個孔中加入100μL檢測試劑B工作溶液（即用型試劑盒中的檢測溶液B）。用Plate密封劑覆蓋后，在37 o C 孵育1小時。
• 如步驟4中所述，重復抽吸/洗滌過程總共5次。
• 每孔加入90μL底物溶液。蓋上新的Plate密封劑。在37 o C 孵育15-25分鐘（不要超過30分鐘）。避光。加入底物溶液后液體會變藍。
• 每孔加入50μL終止液。加入Stop溶液后液體會變黃。通過敲擊板的側面來混合液體。如果顏色變化不均勻，請輕輕敲打板以確保充分混合。
• 去除板底部的任何水滴和指紋，確認液體表面沒有氣泡。運行酶標儀，立即進行450nm的測量。

適用于競爭性ELISA試劑盒

• 確定稀釋標準品，空白樣品和樣品的孔。為標準準備7口井，為空白準備1口井。分別加入50μL標準稀釋液（讀取試劑制備），空白和樣品加入適當的孔中。然后立即向每個孔中加入50μL檢測試劑A（即用型試劑盒中的檢測溶液A）。輕輕搖動平板（建議使用微孔板振蕩器）。用Plate密封劑覆蓋。在37 o C 孵育1小時。檢測試劑A可能會出現混濁。溫熱至室溫并輕輕混合直至溶液看起來均勻。

• 吸出溶液，用噴槍，多通道移液器，歧管分配器或自動洗滌器，每孔加入350μL1×洗滌液，靜置1-2分鐘。通過將板輕敲到吸水紙上，*從所有孔中除去剩余的液體。*洗凈3次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾析除去任何剩余的洗滌緩沖液。翻轉平板并將其吸附在吸水紙上。
• 向每個孔中加入100μL檢測試劑B工作溶液（即用型試劑盒中的檢測溶液B）。用Plate密封劑覆蓋后，在37 o C 孵育1小時。
• 在步驟2中重復抽吸/洗滌過程總共5次。
• 每孔加入90μL底物溶液。蓋上新的Plate密封劑。在37 o C 孵育15-25分鐘（不要超過30分鐘）。避光。加入底物溶液后液體會變藍。
• 每孔加入50μL終止液。加入Stop溶液后液體會變黃。通過敲擊板的側面來混合液體。如果顏色變化不均勻，請輕輕敲打板以確保充分混合。
• 去除板底部的任何水滴和指紋，確認液體表面沒有氣泡。運行酶標儀，立即進行450nm的測量。

注意：

• 分析準備：為每個實驗保留適當數量的孔，并從微孔板中移除額外的孔。剩余的井應重新密封，并保存在-20 o C的傳統套件中，4 o C的即用型套件。  
• 樣品或試劑添加：請使用新制備的標準品。小心地將樣品加入孔中并輕輕混合以避免起泡。不要觸摸井壁。對于該程序中的每個步驟，將試劑或樣品添加到測定板的總分配時間不應超過10分鐘。這將確保每個移液步驟的相等的經過時間，而不會中斷。建議復制所有標準品和標本，盡管不是必需的。為避免交叉污染，在添加標準品，樣品和試劑之間更換移液器吸頭。此外，對每種試劑使用分離的儲庫。
• 孵育：為了確保準確的結果，需要在孵育步驟中適當粘附板密封劑。在孵化步驟之間不允許孔長時間未被覆蓋。一旦將試劑添加到孔條中，在測定期間不要讓條帶干燥。必須控制孵育時間和溫度。
• 洗滌：洗滌程序至關重要。在每個步驟中*去除液體對于試劑盒的良好性能是*的。后一次清洗后，通過抽吸或傾析除去任何殘留的清洗液，并去除板底部的任何水滴或指紋。洗滌不足將導致精度差和吸光度讀數錯誤升高。
• 控制反應時間：觀察加入TMB底物后的顏色變化（例如每10分鐘觀察一次），如果顏色太深，則提前加入終止溶液以避免過強的反應，這將導致吸光度讀數不準確。
• TMB底物  很容易被污染。保護它免受光線和物理污染。 
• 環境濕度可能對從試劑盒獲得的結果產生影響。如果您工廠的濕度低于60％，建議使用加濕器。

測試原理

用于夾心ELISA試劑盒

該試劑盒中提供的微量滴定板預先涂有對靶抗原特異的抗體。然后將標準品或樣品加入適當的微量滴定板孔中，用對靶抗原特異的生物素綴合的抗體制劑。接下來，將與辣根過氧化物酶（HRP）綴合的抗生物素蛋白加入每個微孔板孔中并孵育。在添加TMB底物溶液后，僅含有靶抗原，生物素綴合的抗體和酶綴合的抗生物素蛋白的孔將顯示顏色變化。通過添加硫酸溶液終止酶 - 底物反應，并且在450nm±10nm的波長下通過分光光度法測量顏色變化。然后通過比較樣品的OD與標準曲線確定樣品中靶抗原的濃度。

適用于競爭性ELISA試劑盒

該測定采用競爭性抑制酶免疫測定技術。將靶抗原特異性的單克隆抗體預先包被在微孔板上。在生物素標記的靶抗原和未標記的靶抗原（標準品或樣品）之間啟動競爭性抑制反應，其中預涂的抗體對靶抗原具有特異性。溫育后，洗去未結合的綴合物。接下來，將與辣根過氧化物酶（HRP）綴合的抗生物素蛋白加入每個微孔板孔中并孵育。結合的HRP綴合物的量是反向正比于樣品中的靶抗原的濃度。加入底物溶液后，顯色的強度與樣品中靶抗原的濃度成比例。

結果計算

用于夾心ELISA試劑盒

平均每個標準品，對照品和樣品的重復讀數，然后減去平均零標準光密度。通過繪制每個標準品的平均OD和濃度構建標準曲線，并通過圖表上的點繪制宜擬合曲線，或在log-log圖紙上創建標準曲線，其中y軸上的目標抗原濃度和吸光度x軸。還建議使用繪圖軟件（例如，曲線專家1.30）。如果樣品已稀釋，則從標準曲線讀取的濃度必須乘以稀釋倍數。

適用于競爭性ELISA試劑盒

該測定采用競爭性抑制酶免疫測定技術，因此樣品中的靶抗原濃度與測定信號強度之間存在負相關。平均每個標準品，對照品和樣品的重復讀數。在對數 - 對數或半對數圖紙上創建標準曲線，在y軸上記錄目標抗原濃度，在x軸上記錄吸光度。通過標準點繪制宜擬合直線，或者可以通過回歸分析確定。還建議使用繪圖軟件（例如，曲線專家1.30）。如果樣品已稀釋，則從標準曲線讀取的濃度必須乘以稀釋倍數。

靈敏度

該測定的靈敏度或檢測下限（LLD）被定義為可以與零區分的低蛋白質濃度。通過將兩個標準偏差加到二十個零標準重復的平均光密度值并計算相應的濃度來確定。

夾心ELISA試劑盒的典型數據

為了使計算更容易，我們繪制標準的OD值（X軸）與標準的已知濃度（Y軸），盡管濃度是自變量，OD值是因變量。然而，標準曲線的OD值可以根據測定性能的條件（例如操作者，移液技術，洗滌技術或溫度效應）而變化，建議繪制數據的對數以建立每個測試的標準曲線。有關典型的標準曲線，請參閱套件中包含的手冊。

確定所有套件精度的一般方法如下所述?？筛鶕筇峁﹤€人批量套件的規格。

• 測定內精密度（測定內的度）：分別在一個平板上測試3個具有低，中和高水平指數的樣品20次。
• 批間精密度（測定之間的度）：在3個不同的平板上測試3個具有低，中和高水平指數的樣品，每個平板8個重復。
• CV（％）= SD /平均值（X）100
  • 分析內：CV <10％
  • Inter-Assay：CV <12％

穩定性

我們的ELISA試劑盒的穩定性取決于活性喪失的速率。在適當的儲存條件下，我們的試劑盒的失效率在失效日期內通常低于5％。

為盡量減少外部對我們套件性能的影響，應始終控制操作程序和實驗室條件。需要特別注意的因素包括：室溫，空氣濕度和培養箱溫度。還強烈建議整個測定由相同的實驗者從開始到結束進行。

分析程序摘要

用于夾心ELISA試劑盒

• 準備所有試劑，樣品和標準品;
• 每孔加入100μL標準品或樣品。在37 o C 孵育2小時;
• 吸出并加入100μL制備的檢測試劑A（即用型試劑盒中的檢測溶液A）。在37 o C 孵育1小時;
• 吸3次洗凈;
• 加入100μL制備的檢測試劑B（即用型試劑盒中的檢測溶液B）。在37 o C 孵育1小時;
• 吸取并洗滌5次;
• 加入90μL底物溶液。在37 o C 孵育15-25分鐘;
• 加入50μL終止液。立即讀取450nm。

適用于競爭性ELISA試劑盒

• 準備所有試劑，樣品和標準品;
• 每孔加入50μL標準品或樣品。然后立即加入50μL制備的檢測試劑A（即用型試劑盒中的檢測溶液A）。搖晃和混合。在37oC孵育1小時;
• 吸3次洗凈;
• 加入100μL制備的檢測試劑B（即用型試劑盒中的檢測溶液B）。在37oC孵育1小時;
• 吸取并洗滌5次;
• 加入90μL底物溶液。在37oC孵育15-25分鐘;
• 加入50μL終止液。立即讀取450nm。

重要的提示

• 受現有條件和科學技術的限制，不可能對供應商提供的原材料進行全面的鑒定和分析測試。因此，可能存在一些定性和/或技術風險。
• 終的實驗結果將與產品的有效性，終用戶的操作技能和實驗環境密切相關。請確保有足夠的樣本可以獲得準確的結果。
• 不同批次的試劑盒在檢測范圍，靈敏度和顯色時間上可能略有不同。請*按照套件中包含的使用說明書進行實驗。我們的電子版僅供參考。
• 不要將試劑從一個試劑盒中混合或替換為另一個試劑盒。僅使用制造商提供的試劑。
• 在儲存和孵育期間保護所有試劑免受強光照射。所有試劑瓶蓋應緊密關閉，以防止液體蒸發和微生物污染。
• 當次打開板時，孔中可能存在霧狀物質。它對終的測定結果沒有任何影響。在需要之前，不要從儲存袋中取出微量滴定板。
• 試劑準備和裝載過程中的程序不正確，以及讀板器的參數設置不正確可能導致錯誤的結果。在450±10nm波長下帶寬為10nm或更小且光密度范圍為0-3OD或更大的微孔板讀數器可用于吸光度測量。請仔細閱讀說明書并在實驗前調整儀器。
• 即使是同一個實驗者也可能從兩個獨立的實驗中獲得不同的結果。為了獲得更好的可重復結果，應該控制測定中每個步驟的操作。此外，建議在每批次的一般測定之前進行初步實驗。
• 每個套件都經過了幾次嚴格的質量控制測試。但是，由于某些意外的運輸條件或不同的實驗室設備，終用戶的結果可能與我們的內部數據不一致。不同批次的試劑盒之間的測定內差異也可能來自上述因素。
• 來自不同制造商的相同產品的套件可能會產生不同的結果，因為我們沒有將我們的產品與其他制造商進行比較。
• 該試劑盒中的標準品以及抗體制備中使用的抗原通常是重組蛋白質。不同表達的序列，表達系統和/或純化方法可用于制備重組蛋白。在我們的試劑盒中，抗體和抗體對的篩選技術也存在差異。因此，我們無法保證我們的試劑盒能夠檢測其他公司生產的重組蛋白。我們不建議使用Reddot Biotech ELISA試劑盒檢測其他重組蛋白。
• 有效期：12個月。
• 說明手冊也適用于48T套件，但48T套件中的所有試劑都減少了一半。

預防

提供與該試劑盒一起使用的終止溶液是酸溶液。使用此試劑時，請佩戴眼睛，手，臉和衣物。